| |
 |
Форма - краткая версия
Двое английских биохимиков, А. Мартин и Р. Синг изобрели технологию, при которой смесь аминокислот, полученную в ходе распада определенной молекулы белка, наносили на пористую фильтровальную бумагу и высушивали после этого. Затем край бумаги опускали в органическую жидкость, которая медленно пропитывала весь лист снизу доверху, поднимаясь по капиллярам. Опустите уголок промокашки в стакан с водой, и вы наглядно убедитесь в том, как действует капиллярность.
По мере того, как жидкость поднимается через область с высохшим пятном смеси аминокислот, она протягивает с собой эти аминокислоты. Каждая аминокислота протягивается со свойственной только ей скоростью, и таким образом их все можно отделить друг от друга. Разработать методы идентификации аминокислот после того, как они займут каждая свое место на листе бумаги, оказалось уже делом несложным.
Технология эта получила название бумажная хроматография, и она впервые позволила с точностью определять все аминокислоты, входящие в состав того или иного белка. Таким образом завершился первый этап разгадки строения белка, и, начиная с конца 40-х годов 20 века, был установлен аминокислотный состав многих белков. (1)
(1) За изобретение этой технологии Мартин и Синг получили в 1952 году Нобелевскую премию в области химии.
Но это был только первый этап. Сразу же началась работа над вторым. Как только технология Мартина-Синга получила широкое распространение, английский биохимик Фредерик Сенгер решил и проблему второго этапа.
Он избрал метод частичного разложения белковой молекулы. Вместо того, чтобы окончательно разбивать ее на аминокислоты, он прерывал процесс после получения коротких пептидов, по две-три аминокислоты в каждом. Эти маленькие пептиды химик подвергал методу бумажной хроматографии, разделял их на группы и работал дальше с каждой группой отдельно. Постепенно ему удалось установить порядок следования аминокислот в каждой из этих коротких пептидных цепочек (работа кропотливая, но выполнимая), а затем методично вычислил, каким именно образом аминокислоты должны были быть составлены в цепочку, чтобы при распаде этой цепочки получились именно такие пептиды и никаких других. Так, к 1953 году Сенгер установил точный порядок следования аминокислот в молекуле белка инсулин. (1)
(1) За что и получил в 1958 году Нобелевскую премию.
Американский биохимик Винсент дю Виньо с помощью методики Сенгера определил точное строение еще двух белковых молекул - окситоцина и вазопрессина. Это оказались на удивление простые соединения, так что дю Виньо смог продвинуться на шаг дальше Сенгера - он занялся синтезом и составил аминокислоты вместе в том порядке, который установил в ходе своих экспериментов. В результате получились синтетические молекулы, обладавшие всеми свойствами и выполнявшие все функции природных белков. Это было самое лучшее доказательство всех теорий строения белка, которые выдвигались со времен Фишера. (1)
(1) И эта работа произвела такое впечатление, что дю Виньо стал Нобелевским лауреатом в области химии в 1955 году, прямо в год совершения своего открытия, в то время как Сенгеру пришлось ждать оценки своих более общих работ еще три года.
Так был преодолен и второй этап решения проблемы, и теперь давайте остановимся и рассмотрим результаты. Начнем с вазопрессина, одного из двух белков, синтезированных дю Виньо.
Вазопрессин принадлежит к классу веществ, называемых гормонами. Он производится отдельным органом (задней долей гипофиза, железы, расположенной у основания головного мозга) и вбрасывается в кровоток. Как и все гормоны, он в небольших количествах серьезно влияет на всю биохимию организма, в частности - повышает кровяное давление и регулирует почечную деятельность, предотвращая обезвоживание. Если вазопрессин вырабатывается организмом в недостаточных количествах, то развивается заболевание, именуемое несахарным диабетом, при котором больной выделяет в чрезмерном количестве мочу и все время хочет пить.
Дю Виньо выяснил, что бычий вазопрессин состоит из восьми различных аминокислот. Вот их список: 1) аргинин; 2) аспарагин; 3) цистин; 4) глютамин; 5) глицин; 6) фенилаланин; 7) пролин и 8) тирозин.
В процессе установления порядка их следования химик обнаружил, что два аминокислых участка молекулы цистина находятся на разных участках полипептидной цепочки, так, что цепочка эта на одном своем участке изгибается, создавая петлю, удерживаемую дисульфидной связью. Кроме того, выяснилось, что молекула глицина находится на незагнутом участке цепочки, и что карбоксильная группа этой аминокислоты видоизменена до состояния амидной группы (такая модификация глицина носит название глицинамид).
Кроме вазопрессина, задняя доля гипофиза производит также окситоцин, второй белок, синтезированный дю Виньо. Он тоже состоит из восьми аминокислот, шесть из которых - те же, что и в вазопрессине, а различия с вазопрессином состоят в том, что вместо фенилаланина в окситоцине присутствует изолейцин, а вместо аргинина - лейцин.
Если сравнить формулы, то видно, что различаются они только тем, что в молекуле окситоцина отсутствуют имеющиеся в вазопрессине бензольное кольцо и трехазотная гуанидовая комбинация.
Разница кажется незначительной, но влияние ее на функции этих белков огромно. Окситоцин не поднимает кровяного давления, как вазопрессин, и не оказывает такого спасительного действия на больных, страдающих несахарным диабетом. Зато он вызывает сокращение гладких мышц, особенно матки, так что может служить полезным инструментом для стимулирования родов. (Почему замена двух радикалов приводит к таким разительным функциональным отличиям - до сих пор неясно).
Однако, замена двух радикалов из восьми - изменение вполне масштабное в процентном соотношении. Более мелкие изменения не вызывают потерь функциональности. Так, например, в вазопрессине свиньи семь из восьми аминокислот идентичны тем, что обнаруживаются в бычьем вазопрессине и расположены в том же порядке. Единственным различием является тот факт, что там, где в бычьем вазопрессине расположен аргинин, в свином находится лизин. Чтобы продемонстрировать эту разницу, изобразим "хвост" молекулы - участок вне цистиновой петли.
Как видите, различие гораздо меньше, чем между вазопрессином и окситоцином. В свином вазопрессине сохраняется бензольное кольцо, которого недостает в окситоцине. Кроме того, он не утратил всех трех атомов азота, которые имеются в бычьем вазопрессине, но отсутствуют в окситоцине. При замене аргининового радикала на лизиновый один атом азота в радикале все равно сохраняется. В общем, разница достаточно мала, чтобы не повлиять на функциональность белка. Как свиной, так и бычий вазопрессин в равной степени способны облегчать страдания больных несахарным диабетом.
Можно провести аналогию между тремя маленькими молекулами гормонов и тремя восьмисловными предложениями:
1. Джон Джоунс больно ударил Мэри Смит в глаз.
2. Джон Джоунс нежно поцеловал Мэри Смит в глаз.
3. Джон Джоунс нежно поцеловал Мэри Смит в глаза.
Во втором предложении я изменил два слова из первого, и смысл его полностью изменился. Джон Джоунс превратился из грубияна в героя-любовника, и реакция Мэри Смит в обоих случаях наверняка была разной. Такой же представляется и разница между вазопрессином и окситоцином.
Третье предложение одним словом - "глаза" - отличается от второго. Тем не менее, смысл третьего и второго предложения практически одинаков. Такова же и разница между бычьим и свиным вазопрессином.
Однако, некоторая разница между вторым и третьим предложениями все же имеется, хоть ее и недостаточно для общего изменения смысла. Третье предложение подразумевает как минимум два поцелуя, и, тем самым, говорит о более теплых чувствах или более близких отношениях. Таким же образом можно сказать и о том, что если химические механизмы, действующие в гипофизе свиньи, производят продукт, отличающийся от продукта гипофиза коровы, то значит, механизмы эти должны чем-то различаться, пусть даже функции этих продуктов и совпадают.
Форма - полная версия
Разницу в структуре игнорировать нельзя, даже несмотря на отсутствие при этом разницы функциональной. Почему - я сейчас объясню на примере инсулина, первого белка, в отношении которого был осуществлен второй этап установления структуры.
Инсулин - это гормон, вырабатываемый определенными клетками поджелудочной железы. Его присутствие необходимо на одном из участков химической цепи расщепления организмом сахара с целью получения энергии. Если в организме недостаточно инсулина, распад сахара замедляется, и развивается тяжелое заболевание, известное, как сахарный диабет.
Молекула инсулина устроена чуть посложнее, чем окситоцин или вазопрессин. Она содержит пару полипептидных цепочек, скрепленных между собой дисульфидными связями. Их называют "цепь А" и "цепь В". Цепь А состоит из 26 аминокислот, а цепь В - из 30. Часть цепи А формирует петлю благодаря дисульфидной связи молекулы цистина, как это происходит в вазопрессине и окситоцине. В эту петлю входят, помимо самой молекулы цистина, еще три аминокислоты.
Исследованию подвергались молекулы инсулина, производимые поджелудочной железой самых разных животных, и все они, за исключением дисульфидной петли, совпадали до мелочей. Кажется, любое изменение в порядке или номенклатуре аминокислот, не входящих в дисульфидную петлю, лишает инсулин функциональности.
Однако три аминокислоты, входящие в дисульфидную петлю, могут видоизменяться от одного вида животных к другому, что не влияет на функцию, выполняемую инсулином. Варианты показаны на рис. 34.
Раз эти изменения не влияют на функциональность инсулина, то имеют ли они значение? Понятно, что для химика, занимающегося химией белков, они в любом случае представляют теоретический интерес, но есть ли у них практическое значение? Как ни странно, да, есть.
Как правило, введение инсулина не вызывает формирования антител. Это очень хорошо, потому что больным, страдающим сахарным диабетом, требуются периодические инъекции инсулина, и было бы нежелательно каждый раз получать вспышку иммунной реакции в ответ на введение чужеродного, но столь необходимого белка. Однако в некоторых случаях у больных может развиться индивидуальная реакция такого рода на инсулин, полученный от крупного рогатого скота, что означает на практике непереносимость инъекций. В таких случаях обычно достаточно бывает сменить бычий инсулин на свиной. Двухпроцентной разницы между этими двумя инсулинами недостаточно, чтобы повлиять на функциональность лекарства, но вполне достаточно, чтобы антитела для него требовались уже другие. Организм, готовый в любой момент начать выработку антител против бычьего инсулина, не будет вырабатывать их в ответ на введение инсулина свиного, так что его вполне можно применять без опасения острой реакции.
После всего вышеизложенного может показаться, что полная фактическая форма аминокислот не имеет значения, и ей можно пренебречь. В вазопрессине спокойно можно заменить одну аминокислоту из восьми (12%), и это никак не скажется на его функциональности. То же самое можно сделать с тремя аминокислотами из пятидесяти в инсулине (6%). Условия кажутся вполне либеральными.
Ну, в какой-то степени это так и есть - но не всегда настолько.
Давайте рассмотрим гемоглобин, белок красных кровяных телец, разносящий кислород. Я уже упоминал его в данной книге. Нормальные молекулы гемоглобина, встречающиеся практически у всех людей, имеют общее название "гемоглобин А".
Существуют люди (к счастью, их немного), чей организм вырабатывает аномальный гемоглобин. В качестве двух примеров аномального гемоглобина можно привести гемоглобин S и гемоглобин С. Аномальные гемоглобины хуже захватывают кислород, чем гемоглобин А. Далее, при определенных обстоятельствах аномальный гемоглобин может кристаллизоваться внутри красных кровяных телец, повреждая при этом их мембрану. Поэтому жизнь красных кровяных телец с аномальным гемоглобином короче, чем телец с гемоглобином А. Если наряду с гемоглобином С или S организм человека может производить и гемоглобин А, то этот человек может быть практически здоровым, но если аномальный гемоглобин - это все, что может производить организм, то его хозяин обречен на раннюю смерть.
Молекула гемоглобина в десять раз крупнее молекулы инсулина. Она содержит 574 аминокислоты, распределенных между четырьмя полипептидными цепочками, удерживаемыми вместе дисульфидными связями и силой электрического притяжения. Две из них являются одинаковыми "альфа-цепочками" из 141 аминокислоты каждая, а две других - одинаковыми же "бета-цепочками" из 146 аминокислот каждая.
В состав цепочек одной из этих пар включена в определенном месте глютаминовая кислота. Если ее в обеих цепочках пары вдруг заменить на валин, то вместо гемоглобина А мы получаем в целом гемоглобин S, а если на лизин - то гемоглобин С. Все остальные пятьсот с лишним аминокислот молекулы остаются при этом теми же самыми и на тех же местах (по крайней мере, об обратном нам ничего не известно). Таким образом, получается, что разница на две аминокислоты в одном-единственном белке, в котором их 574 - это грань между здоровой жизнью и ранней смертью.
Из этого следует, что форма белка крайне важна, вплоть до малейшей детали, и ни на какой "допуск" полагаться нельзя.
Начиная с 1953 года, когда впервые был решен второй этап задачи, подобным же образом были разобраны еще несколько белков, в том числе - и более сложных. В полипептидных цепочках вазопрессина и окситоцина всего восемь аминокислот; в самой длинной цепочке инсулина - всего тридцать. Однако в 1960 году было рассчитано положение всех аминокислот и в ферменте, получившем название рибонуклеаза, в котором содержится цепочка длиной в целых 214 аминокислот, изогнутая несколькими сложными петлями под воздействием не менее четырех дисульфидных связей между разными участками цепочки.
В общем, уже нет никаких сомнений, что воспроизвести на уровне состава и очередности аминокислот теперь можно любой белок, имея достаточный запас самого белка в чистом виде, а заодно - времени и терпения. Но как же третий этап? Что мы можем сказать о трехмерных изгибах полипептидных цепочек под воздействием водородных связей?
Сейчас решена уже и эта проблема. В конце 50-х годов английский химик Джон Кендрю, совместно с Максом Фердинандом Перуцем, химиком австрийского происхождения, занимался изучением белка под названием "миоглобин", который обнаружили в мышцах. Как и гемоглобин, он способен переносить кислород; однако, размером он в четыре раза меньше, чем гемоглобин. В состав этого белка входит одна пептидная цепочки и одна железосодержащая гемогруппа, а в гемоглобине и то, и другое представлено четырежды. Однако, следует понимать, что единственная полипептидная цепочка миоглобина, состоящая примерно из 150 аминокислот, не является структурой, "оторванной от гемоглобина". Нет, она имеет абсолютно другое строение.
Кендрю подверг кристаллы миоглобина исследованию методом рентгеновской кристаллографии (я еще расскажу подробнее об этой методике исследований), и потихоньку смог установить точное положение каждой его частицы. К 1959 году он сумел создать трехмерную модель белка, в которой было точно установлено положение каждого атома, включая атом железа. (1)
(1) За эту работу Кендрю и Перуц удостоились в 1962 году Нобелевской премии в области химии.
Сейчас кажется, что при наличии времени, терпения, и достаточного количества исследуемого вещества в кристаллической форме, можно установить трехмерную модель любого белка. Резюмируя, можно сказать, что на данный момент все три этапа решения задачи успешно преодолены - как минимум, принципиально.
Конечно, впереди еще немало работы. Однако, химики - исследователи белков полны оптимизма, и их можно понять, учитывая то, какой значительный прогресс был проделан с момента изобретения метода бумажной хроматографии - то есть, менее, чем за двадцать лет!
<<... предыдущая стр. :: следующая стр...>>
п»ї1 :: 2 :: 3 :: 4 :: 5 :: 6 :: 7 :: 8 :: 9 :: 10 :: 11 :: 12 :: 13 :: 14 :: 15 :: 16 :: 17 :: 18 :: 19 :: 20 :: 21
| |
| |
|
|
|
